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    MDCK細(xì)胞培養(yǎng)

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-29  點(diǎn)擊次數(shù): 1254次
    簡介


    一、目的
    MDCK細(xì)胞培養(yǎng)是分離流感病毒及相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)。疾控中心的所有技術(shù)人員,必須按照本文件相關(guān)的操作規(guī)程進(jìn)行操作。
    二、適用范圍
    適用于疾控中心所有技術(shù)人員 。
    三、程序
    (一)生物安全要求
    實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別:BSL-1
    所有操作必須在BSL-1實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里進(jìn)行。



    材料與儀器


    二)材料
    1. 生長成片的MDCK細(xì)胞
    2. 無菌的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶
    3. D-MEM培養(yǎng)液(含有L-谷氨酰胺)
    4. 青、鏈霉素母液(10000 U/mL青霉素G;10000µg/mL硫酸鏈霉素),分裝后保存于-20℃
    5. HEPES緩沖液,1M母液
    6. 胎牛血清
    7. EDTA -胰酶(0.05%胰酶,0.53mMEDTA-4Na),分裝后保存于-20℃
    8. 7.5%牛血清白蛋白組分V
    9. 1mL、10mL無菌移液管
    10. 70%~75%的酒精
    注意事項(xiàng):經(jīng)常檢查試劑使用的有效期。



    實(shí)驗(yàn)步驟


    (三)實(shí)驗(yàn)步驟
    這里以T75細(xì)胞瓶的單層細(xì)胞培養(yǎng)為例,敘述MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)程序。如果細(xì)胞瓶的規(guī)格有變,MDCK細(xì)胞懸液的量必須做相應(yīng)的調(diào)整。
    1. D-MEM培養(yǎng)液的準(zhǔn)備
    500mL D-MEM液中加入:
    青、鏈霉素母液5mL(終濃度達(dá):100U/mL青霉素;100µg/mL鏈霉素),
    HEPES緩沖液12.5mL(終濃度:25mM)。
    7.5%牛血清白蛋白組分Ⅴ 12.5mL
    2. 細(xì)胞生長液的準(zhǔn)備
    胎牛血清10mL加到90mL的上述(1)的液體中,使胎牛血清的終濃度為10%。
    3. 首先將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液棄去,加入5mL在37℃水浴中預(yù)熱的EDTA-胰酶。
    4. 溫和地?fù)u動(dòng)細(xì)胞瓶1min,使EDTA-胰酶均勻分布在整個(gè)細(xì)胞薄層。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
    5. 重新加入5mL在37℃水浴中預(yù)熱的EDTA-胰酶重復(fù)上述步驟。
    6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均勻分布在整個(gè)細(xì)胞薄層,37℃孵育細(xì)胞瓶直至細(xì)胞從塑料細(xì)胞瓶的表面分離(約5~10min)。必要時(shí)可以搖動(dòng)或吹打來分離細(xì)胞。然后加入1mL胎牛血清滅活殘余的胰酶。
    7. 加9mL已經(jīng)配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培養(yǎng)液,輕輕用移動(dòng)移液管來吹散細(xì)胞團(tuán)。
    8. 取10mL混合物加到90mL細(xì)胞生長液(細(xì)胞懸液的濃度大約為每毫升含105細(xì)胞)
    9. 每個(gè)T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入6mL(6×105/mL)細(xì)胞懸液,剩余的細(xì)胞懸液可以加到T75細(xì)胞瓶用于細(xì)胞傳代。通常6mL細(xì)胞懸液2~3日可生長成片(80%~90%)的單層細(xì)胞。
    10. 于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)細(xì)胞,每天觀察細(xì)胞狀態(tài),以供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用。



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