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備擇方案 3 長期細胞標記

發(fā)布時間： 2022-03-10　　點擊次數： 1699次

原理
長期標記意味著對細胞進行 6～32 h 持續(xù)的代謝標記。該方法特別適用于研究合成速度相對較慢的蛋白質或研究成熟的標記蛋白而不是生物合成的前體。穩(wěn)定狀態(tài)的標記是長期標記的一種形式，在此過程細胞和放射性標記的氨基酸一起孵育直至放射性標記蛋白的合成和降解速率相當。如果蛋白質復合體中的亞基的初級結構已知，該方法可以對這些亞單位進行化學計量。所加入的未標記的甲硫氨酸量依賴于某些因素，如標記的時間和細胞濃度。通常使用的培養(yǎng)基中含有 5％～20％正常的非標記甲硫氨酸含量。
材料與儀器
細胞懸液／貼壁細胞 [35S]標記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標記蛋白質水解產物
PBS(冷凍) 37℃ 長期標記培養(yǎng)基
75 cm2 組織培養(yǎng)瓶
步驟
1. 在預熱的 37℃ 長期標記培養(yǎng)基中制備 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（見基本方案步驟 1）。

2.1 對于懸浮細胞：用預熱的長期標記培養(yǎng)基準備并洗細胞一次（見基本方案步驟 2）。

在 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液中重懸 0.5 ×107～2 ×107 細胞，并轉移到 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中。

2.2 對貼壁細胞： 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中生長 0.5 ×107 ～2 ×107 的貼壁細胞（80% ～90%融合），在 CO2 培養(yǎng)箱中。用預熱的長期標記培養(yǎng)基洗細胞一次（見備擇方案 1 步驟 3）。每個 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中加入 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液。

3. 擰緊蓋子以防 [35S] 標記的化合物揮發(fā)。在 CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng) 16 h。

4. 洗細胞并測定摻入量（見基本方案步驟 5～7；或備擇方案 1 步驟 6～8）
注意事項
常見問題
同實驗其他方法
氨基酸代謝標記實驗
1. 室溫融化 [35S] 標記甲硫氨酸，并用預熱的（37℃）脈沖標記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~
備擇方案 1 對貼壁細胞
1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細胞，取決于細胞類型）。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見基本方案步驟 1
備擇方案 2 示蹤標記細胞
1. 每個時間點和每個樣品準備 0.5 × 107 ~2 × 107 細胞，每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標記
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