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    PCR 引物設(shè)計(jì)

    發(fā)布時(shí)間: 2023-05-05  點(diǎn)擊次數(shù): 1140次

    好的引物會(huì)讓 PCR 實(shí)驗(yàn)成功一半,因而,引物設(shè)計(jì)一直都是 PCR 非常重要的環(huán)節(jié)。經(jīng)典之法就是讓 Premier5 攜手 oligo,共同設(shè)計(jì) PCR 引物。

    1、以小鼠的 IL-17 為例,進(jìn)入 NCBI 界面,選擇 Nucleotide 后,輸入 IL-17,點(diǎn)擊 search。然后選擇人類 IL-17 的 mRNA,在 CDS 選項(xiàng)中,找到編碼區(qū)所在位置,在下面的 origin 中,
    選定目的序列。

    2、打開(kāi) Primer Premier5 軟件,點(diǎn)擊菜單欄 File|New|DNA Sequence,在出現(xiàn)的對(duì)話框里黏貼目的序列,并在 paste 對(duì)話框里選擇 As Is,點(diǎn)擊 OK。

    3、點(diǎn)擊 Primer,彈出菜單后點(diǎn)擊 search 按鈕。在彈出的 Search Criteria 中,選擇 PCR primers,Pairs 參數(shù),并選擇所需PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度,點(diǎn)擊 OK。在彈出的 search progress 菜單中,點(diǎn)擊 OK。

    4、在搜索出的結(jié)果列表里選擇 Rating 值高,bug 較少的引物#1,在 Primer Premier 中選擇 S(正義鏈)/A(反義鏈),點(diǎn)擊 edit primer,將所得引物改成為 Rating 值為 100,無(wú) bug 的引物,即無(wú)發(fā)夾(Hairpin)、無(wú)二聚體(Dimer)、無(wú)錯(cuò)配(False Priming)和交叉配對(duì)(Cross Dimer)的引物。點(diǎn)擊 Accept and Quit 命令即可。

    5、點(diǎn)擊菜單欄中 Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer,即可得到設(shè)計(jì)的引物。

    6、接下來(lái),就要用 Oligo 軟件驗(yàn)證評(píng)估 Premier5 軟件所設(shè)計(jì)的引物,單擊菜單欄里 File∣New Sequence 可打開(kāi)以下窗口,并將設(shè)計(jì)好的上游引物黏貼在空白框里。

    7、點(diǎn)擊菜單欄里 Accept/Discard 中的 Accept,則會(huì)出現(xiàn) Tm、△G 和 Frq 三個(gè)窗口, △G 值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度,最好引物的△G 值在 5’端和中間值比較高,而在 3’端相對(duì)較低。

    8、點(diǎn)擊菜單欄里的 Select 中的 Upper Primer 將當(dāng)前引物設(shè)置為上游引物。同時(shí)點(diǎn)擊菜單欄里的 Edit 中的“Lower Primer"命令,在 Edit Lower 窗口中輸入下游引物的序列。點(diǎn)擊 Accept and Quit 命令即可。

    9、最后,在菜單欄中 Analyze 完成引物△G 值、Tm 值、引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的分析后,可將引物序列送至公司進(jìn)行合成即可。


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